基于Mascot的蛋白质组学定量分析
Mascot中，按照定量原理将各类定量技术分为六类。分别是Reporter、Precursor、Multiplex、Replicate、emPAI、Average。
Reporter：基于MS/MS谱图中某些固定质量数的碎片离子之间的相对强度进行定量的方法。比如iTRAQ或Tandem Mass Tags。
Multiplex：基于MS/MS谱图中肽段碎片离子对间的相对强度进行定量。这是一种比较新的定量方法，可以应用于任何能够在肽段末端的化学修饰标记，比如某些改进方法的18O或SILAC方法。
Precursor：基于单一数据集中提取离子色谱（extracted ion chromatograms，XIC）之间的相对强度进行定量。目前这种定量方法是应用较广泛的定量方法，任何可以使母离子带有质量偏移的方法都可以使用。比如18O、AQUA、ICAT、ICPL、Metabolic、SILAC等等。
Replicate：基于多组平行实验间母离子的XIC相对强度的非标记定量，需要对齐质量数和保留时间。
以上四种方法用于测量不同生物学样本件间蛋白质表达的相对差异。比如某个器官受到外界压力或病变时某些特定蛋白的上调或下调。以下两种方法用于评估同一样本中不同蛋白的相对丰度差异。
emPAI：基于数据库搜索结果的肽段匹配信息，计算混合蛋白中各个蛋白之间的相对丰度。
Average：对同一数据集的匹配肽段的XIC强度进行定量，从而得出其蛋白量的相对强度。比如，每个蛋白强度前三的肽段进行差异定量。
下图中，蓝色标注的定量方法可以直接再Mascot Server中进行定量。白色标注的方法需要联用Mascot Distiller。
Protocol | Basis | Ratios | Examples |
Reporter | Specific reporter ion peaks within a single MS/MS spectrum | Inter-sample | iTRAQ、ExacTag、TMT |
Precursor | Extracted ion chromatograms for related precursors within a single dataset | Inter-sample | ICAT、SILAC、18O、ICPL、AQUA、Metabolic |
Multiplex | Pairs of sequence ion fragment peaks within a single MS/MS spectrum | Inter-sample | SILAC、18O |
Replicate | Extracted ion chromatograms for identical precursors across two or more datasets | Inter-sample | Label-free |
emPAI | Protein coverage from a database search result | Intra-sample | N/A |
Average | Extracted ion chromatograms for selected peptides per protein within a single dataset | Intra-sample | N/A |
Mascot Distiller处理定量数据的流程如下，涉及XIC信息的谱图提取、定量均由Distiller完成，中间步骤自动提交Mascot Server进行鉴定，并与定量信息归并。
在进行搜库参数设定时，为了避免用户过多的去猜测该如何设置定量相关设置，Mascot将最常用的定量方法及其修饰情况集成到了Quantitation选项中，我们只需要在下拉菜单中选择对应的定量方法，无须在修饰类型中设定定量相关的修饰。
注意：所有定量方法后带有【MD】字样的方法均需要由Distiller进行处理，网页中直接递交将无法定量。
图1 Mascot支持的定量方法
图2 Mascot Server界面
另外在定量部分还有几个比较关键的概念，也就是在定量方法设置的几个标签：
Method：将搜库，数据process和定量数据报告的方法整合在此。
Protocol：定义定量方法的机制。
Component：在混合样本中识别肽段其来源的特征属性。例如在SILAC实验中，一个component可能是未被修饰的肽段，而其他component可能是Arg或者Lys用13C标记的肽段。如果protocol是reporter，那么这里component就是以报告离子（report）的质荷比值作为区分肽段来源，如果是代谢标记，那么一个component可能是14N的多肽，另一个是15N标记的多肽。
Report ratio：用于设置哪一个component比哪一个component，但是不限于只有两个组分进行比较，可以是component的线性组合（0.5*A+0.5*B-C）/（D+E）。例如18O标记实验，可以报告这样的ratio：（18O1+18O2）/18O0。
1、使用免费桌面客户端Mascot Daemon进行搜库任务提交
2、使用Mascot Distiller提取谱峰信息
①设置MS Processing参数
注意：关闭Mascot Distiller sum scans
△对于来自同一母离子的多次MS2扫描进行合并，可以节约搜库时间，提高信噪比。
△但是，对于定量研究建议关闭sum scans。
②设置MS/MS Processing参数
注意：MS/MS谱图中的Reporter ions并非肽段，因此在MS/MS谱图进行谱峰提取时需要避开这段分子量区域，以免错误优化谱峰导致定量结果失真。
△输入对应方法的reporter ion质量范围，并略微扩大
③Mascot定性定量结果展示（示例）
④Mascot定性定量结果导出
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