基于Mascot的蛋白质组学定量分析

基于Mascot的蛋白质组学定量分析


基本介绍

Mascot中,按照定量原理将各类定量技术分为六类。分别是Reporter、Precursor、Multiplex、Replicate、emPAI、Average。


  • Reporter:基于MS/MS谱图中某些固定质量数的碎片离子之间的相对强度进行定量的方法。比如iTRAQ或Tandem Mass Tags。


  • Multiplex:基于MS/MS谱图中肽段碎片离子对间的相对强度进行定量。这是一种比较新的定量方法,可以应用于任何能够在肽段末端的化学修饰标记,比如某些改进方法的18O或SILAC方法。


  • Precursor:基于单一数据集中提取离子色谱(extracted ion chromatograms,XIC)之间的相对强度进行定量。目前这种定量方法是应用最广泛的定量方法,任何可以使母离子带有质量偏移的方法都可以使用。比如18O、AQUA、ICAT、ICPL、Metabolic、SILAC等等。


  • Replicate:基于多组平行实验间母离子的XIC相对强度的非标记定量,需要对齐质量数和保留时间。


以上四种方法用于测量不同生物学样本件间蛋白质表达的相对差异。比如某个器官受到外界压力或病变时某些特定蛋白的上调或下调。以下两种方法用于评估同一样本中不同蛋白的相对丰度差异。


  • emPAI:基于数据库搜索结果的肽段匹配信息,计算混合蛋白中各个蛋白之间的相对丰度。


  • Average:对同一数据集的匹配肽段的XIC强度进行定量,从而得出其蛋白量的相对强度。比如,每个蛋白强度前三的肽段进行差异定量。


下图中,蓝色标注的定量方法可以直接再Mascot Server中进行定量。白色标注的方法需要联用Mascot Distiller。

Protocol

Basis

Ratios

Examples

Reporter

Specific reporter ion peaks within a single MS/MS spectrum

Inter-sample

iTRAQ、ExacTag、TMT

Precursor

Extracted ion chromatograms for related precursors within a single dataset

Inter-sample

ICAT、SILAC18O、ICPL、AQUA、Metabolic

Multiplex

Pairs of sequence ion fragment peaks within a single MS/MS spectrum

Inter-sample

SILAC18O

Replicate

Extracted ion chromatograms for identical precursors across two or more datasets

Inter-sample

Label-free

emPAI

Protein coverage from a database search result

Intra-sample

N/A

Average

Extracted ion chromatograms for selected peptides per protein within a single dataset

Intra-sample

N/A

Mascot Distiller处理定量数据的流程如下,涉及XIC信息的谱图提取、定量均由Distiller完成,中间步骤自动提交Mascot Server进行鉴定,并与定量信息归并。


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在进行搜库参数设定时,为了避免用户过多的去猜测该如何设置定量相关设置,Mascot将最常用的定量方法及其修饰情况集成到了Quantitation选项中,我们只需要在下拉菜单中选择对应的定量方法,无须在修饰类型中设定定量相关的修饰。
注意:所有定量方法后带有【MD】字样的方法均需要由Distiller进行处理,网页中直接递交将无法定量。

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图1 Mascot支持的定量方法

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图2 Mascot Server界面


另外在定量部分还有几个比较关键的概念,也就是在定量方法设置的几个标签:


Method:将搜库,数据process和定量数据报告的方法整合在此。

Protocol:定义定量方法的机制。

Component:在混合样本中识别肽段其来源的特征属性。例如在SILAC实验中,一个component可能是未被修饰的肽段,而其他component可能是Arg或者Lys用13C标记的肽段。如果protocol是reporter,那么这里component就是以报告离子(report)的质荷比值作为区分肽段来源,如果是代谢标记,那么一个component可能是14N的多肽,另一个是15N标记的多肽。

Report ratio:用于设置哪一个component比哪一个component,但是不限于只有两个组分进行比较,可以是component的线性组合(0.5*A+0.5*B-C)/(D+E)。例如18O标记实验,可以报告这样的ratio:(18O1+18O2)/18O0。


基于Mascot的iTRAQ / TMT标记定量数据分析流程


1、使用免费桌面客户端Mascot Daemon进行搜库任务提交

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2、使用Mascot Distiller提取谱峰信息

①设置MS Processing参数


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注意:关闭Mascot Distiller sum scans

△对于来自同一母离子的多次MS2扫描进行合并,可以节约搜库时间,提高信噪比。

△但是,对于定量研究建议关闭sum scans。

②设置MS/MS Processing参数


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注意:MS/MS谱图中的Reporter ions并非肽段,因此在MS/MS谱图进行谱峰提取时需要避开这段分子量区域,以免错误优化谱峰导致定量结果失真。

△输入对应方法的reporter ion质量范围,并略微扩大

③Mascot定性定量结果展示(示例)


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④Mascot定性定量结果导出


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