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上传时间:2016-04-13 16:19:48
iTRAQ (Isobaric tag for relative and absolutequantitation)和Tandem mass tags(TMT)是目前应用最广泛的两大类化学标记定量技术,其原理一样,区别在于分别由AB和Thermo公司开发销售。
简单来说,iTRAQ、TMT技术的原理是依赖于肽段末端不同的同位素标记以区分样品,二维色谱有效分离,对标记试剂所携带的报告离子强度进行计算以匹配对应肽段量,整合各定量肽段的信息以得出蛋白整体变化趋势。
iTRAQ、TMT技术的优点在于实验流程简单,可以同时标记2-10个样品、样品类型适用性广。缺点在于价格较为昂贵,对LC-MS体系稳定性,分离效率,仪器优化要求较高,定量动态范围较低,低丰度蛋白定量准确性较差。
无论是研究者本人进行iTRAQ、TMT实验还是委托他人进行实验,在进行数据分析或查看分析结果前,都需要对标记效果、LC分离效果进行质控评估,在查看定量结果时,也需要对定量结果重复性、差异显著性进行评估。
本文主要着重介绍使用ScaffoldQ+分析评估iTRAQ、TMT定量结果时需要分析评估的项目。
定量试剂纯度校正

报告离子质量评估

定量分组比较设计

归一化策略设计

定量差异统计检验


定量试剂纯度校正:

定量试剂在生产时由于无法保证100%的纯度,均会有5%~10%左右的其他标记试剂成分。如iTRAQ 4 plex标记试剂由114,115,116,117四个通道组成,115通道试剂通常会包含少量的114和117试剂。因此,质谱仪器检测得到的115通道强度其实是由90%左右115,不到10%的114和117组成。无法完全真实反映实际的样品量。
定量试剂出厂时均会附上该批次试剂质检时的纯度校正系数,帮助使用者在数据分析时进行纯度校正。定量前,在purity correction参数中输入质检报告中的系数即可。
10%不到的杂质是否一定要校正?
有些研究者会觉得不到10%的杂质是否一定需要校正?但是在某些差异较大的样品间,这个差别就会被放大。比如115通道含有5%的114试剂,仪器检测到的114通道强度是1000,而115的是100,那么实际值则应该是1053和47。校正前后比值差了近一倍。
报告离子质量评估

在进行蛋白定量评估前,我们有必要首先评估报告离子(即用于定量的114,115,116,117等分子量的离子)的强度,以确保我们的定量结果真实可靠。我们可以随机选择十几张整体强度较高的MS2谱图,查看其报告离子质量范围内的谱峰分布是否清晰可见、没有干扰、强度足够。通常在MS2谱图分析中,报告离子强度应该高于最强的碎片离子的5%,有时候MS2碎裂母离子峰或某几个碎片峰会非常高,这时可以看其绝对值是否与其它b、y离子接近。这样它的强度不会被噪音干扰,定量准确性也有保证。
为何报告离子强度会很低?
当质谱仪器的碰撞能量调整不合适,不利于报告离子碎裂时会造成此类现象,这种情况下无法通过数据处理过程的优化来提高定量准确性。
另一种情况是质谱数据处理软件提取MS2谱峰列表时进行了去同位素过滤操作,将报告离子误判为肽段碎片而进行去同位素,我们需要重新提取谱峰,并在提取时注意将报告离子峰的质量范围取消去同位素分析。
定量分组比较设计

如果您需要用Scaffold Q+对来自于Mascot,PD,Maxquant等软件的搜库定量结果进行统计评估,或者您需要整合多组来自于以上软件的定量结果,您可以使用Scaffold Q+导入其搜库定量结果文件,并设计标记分组来进行后续分析。
首先,如果您需要在不同样本间的蛋白定量差异是否具有统计学意义下的差异,那么您需要进行多次重复实验。
通常,p-value是用于评估不同组实验间的定量差异是否是由于随机因素导致的概率。
我们以一个4标iTRAQ实验为例:
如果您的iTRAQ实验数据由多个4标样本组成,您需要保证每个样本包含的数据量是一致的。

每个重复样本至少需要有一个通道是Reference。

分组设计1:每次重复实验内部均包含两次重复实验

重复1:A1 A2 B1 B2
重复2:A1 B3 A3 B4
重复3:A1 B5 B6 A4
分组设计2:每次实验内部没有重复,但都包含一次混合上样的通道

重复1:PS A1 B1 C1
重复2:A2 PS C2 B2
重复3:B3 C3 PS A3
重复4:C4 A4 B4 PS
此时Pool Sample(PS)可以作为Reference也可以不作。(Pool Sample指每种样本等量混合上样)
如果您的实验设计更为复杂,如

A1B1 C1 C2
A2A3 B2 C3
A4B3 B4 C4

A1B1 C1 D1
E1F1 A2 B2
C2D2 E2 F2
那么您需要将原始定量信息导出,在其他程序中设计统计方法来分析了。

何为Reference Sample
在进行定量分析时,iTRAQ定量结果一般以A/Ref, B/Ref这样的差异值来展示两组报告离子间的差别,所有样本均需要和分母,即某个或某组特定的Reference Sample进行差异比较来获得比值。可以认为我们的定量结果就是各组分别和某一个组的蛋白的量来进行比较的结果。
如果我们进行归一化的话,每个通道的样本的蛋白量会校正为同一水平,即我们认为不同分组间生物体表达的蛋白总体规模应该是一致的。
如果您有多组实验,如2次4标实验,那么会以每一组的reference通道的量为标准进行归一化。
归一化策略设计

何时需要进行归一化
当我们认为不同样品间大多数蛋白的表达量应该是相似的,差异蛋白是其中的小部分蛋白,并且上调和下调的蛋白的数量应该接近时,我们可以选择归一化处理定量结果,以消除上样量的差异。
如果我们发现有一定的看家蛋白或者人为加入了某些标准蛋白,它们的量在不同实验中不会发生变化,我们也可以考虑以这些蛋白的定量信息来进行归一化。
何时不需要进行归一化
当你知道不同样品间的蛋白表达量差异很大,或者不同样品进行了不同的富集操作时,归一化将带来较大误差。
另一种情况是,如果您需要将定量信息导出到其他程序进行进一步的统计或归一化分析时,请不要在Scaffold Q+中进行归一化。
确认归一化有效
当进行归一化后,我们可以统计蛋白上下调的总体分布,如果发现大多数蛋白的差异不显著,同时上下调的蛋白数量比较接近时,我们可以认为归一化有效。
当不同样本间差异过大,或者不同通道的标记效率差异过大,那么归一化将失效。
定量差异统计检验

通常我们使用ANOVA t-test来进行差异显著性计算。ANOVA检验可以告诉您两组样本或更多组样本间是否存在显著差异蛋白,其差异不应该是随机的。当某个蛋白的t-test值小于0.05时,我们可以认为这个蛋白在不同分组(至少两组)间的差异是显著的。

A1A2 B1 B2
B4A3 A1 B3
如果分组A中某蛋白的含量显著大于分组B,那么A组与B组之间的定量差异应该显著大于A组或B组内部重复间的差异。
另外,蛋白定量信息是由来自于该蛋白的多个谱图的定量信息计算得到的。比如某蛋白在第一次重复时检测到了5张谱图,第二次重复时检测到了6张谱图,那么Scaffold Q+会结合这11张谱图的定量信息进行ANOVA检验。
当同一重复实验的多个标记间没有样本重复时,ANOVA检验是如何进行的

PSA1 B1 C1
A2PS C2 B2
B3C3 PS A3
C4A4 B4 PS
ANOVA 检验模型会假设:1.某蛋白的每张谱图均对蛋白定量结果有一定贡献。其中一部分谱图的强度可能比其他一些的高几百倍。本模型会将这样的贡献在计算定量结果是进行加权;2. 同一张谱图的不同报告离子会有不同的强度值,ANOVA模型认为它们的差异可能来自于真实的蛋白量的差异也可能是来自于仪器测量的波动。
ANOVA模型目的是寻找不同分组间的蛋白表达量差异大于测量波动差异的结果。如何来评估测量波动的大小?ANOVA模型假设测得的报告离子强度信息是以下三种来源的加和:1. 该谱图的平均强度;2.该实验分组的平均强度;3.仪器测量随机波动。ANOVA模型从测得的报告离子强度中会减去谱图的平均强度和该分组的平均强度来得到随机的仪器测量波动大小。ANOVA模型的F检验使用多组实验分组间的定量差异来计算p-value。当p-value足够小时,我们可以认为这个蛋白在多个分组间的表达量差异是显著的。

本文由Proteomesoftware提供英文版;康昱盛沈诚频修改并翻译。