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上传时间:2017-03-23 10:14:20
献给做完基因功能富集分析不知所措朋友--植物H.incana在重金属铅胁迫下的耐受机制-基因表达谱研究案例


很多人以为,分析就是做图表。图表完成了,分析也就完成了。其实,做完图表只是第一步而已。用不了的图表,和噪音没有区别。

文章题目:Transcriptome Changes in Hirschfeldia incana in Response to Lead Exposure(PMID:26793211)
发表杂志:Frontiers in Plant Science
影响因子:4.495
实验方法:Agilent  4*44K 拟南芥表达谱芯片



研究背景

说到重金属,一些是对生物体有益的,比如Cu,Mn或Zn的重金属在许多植物生理过程中起重要作用.也有一些是非必须的,比如铅。

它不参与生物体功能正常运行,而且哪怕低浓度也是极毒性.由于许多人类活动,包括采矿和冶炼, 燃煤,水泥制造和农业实践,使得铅在环境中广泛存在。铅被认为是一种严重的污染物,它不仅对吸收铅的植物根部有毒,而且在转移到可以积累的地上部分时也是有毒的. 比如,种子萌发的快速抑制,减少生长和出现褪绿。

然而,一些植物物种耐受铅的存在。机制主要有 :
一是外排和阻止重金属的吸收来减少其在植物体内的含量 ;
二是通过络合作用和螯合作用,减少细胞中游离的金属离子 ;
三是通过提高抗氧化酶活性来清除活性氧和自由基。

比如,烟草质膜蛋白NtCBP4和拟南芥基因CNGC1为铅转运途径的重要组分( Sunkar等人,2000)。拟南芥的P型ATP酶HMA3,可以通过把铅隔离在液泡中,改善耐受性;HMA4,另一种P型ATP酶,可能在N. caerulescens和H. incana中使得铅排除体外;在拟南芥中,ABC(ATP酶结合盒)转运蛋白家族AtATM3,AtPDR12和AtPDR8的三个成员参与到了重金属离子的运输,有助于提高植物对铅的抗性;ACBP1是一种酰基辅酶A结合蛋白,参与通过在拟南芥的芽中积累来介导铅耐受, AtMRP3已被证明在拟南芥中受到铅刺激以后转录本高表达。这些分子是通过与重金属的螯合而提高植物的抗毒性。

短荚芥(Hirschfeldia incana),因为其广泛分布在地中海地区,也叫地中海芥菜或地中海芥末,是属于十字花科的中等多年生灌木。它已被确定为各种有毒金属(包括铅)的潜在超累积剂(Auguy等,2013)。

有人做过实验发现,当含有100μM铅离子溶剂水培溶液中生长时没有任何明显的毒性症状,短荚芥(Hirschfeldia incana)显示能够在其芽中积累超过3%(干重)的铅。也就是说, 这种植物可以有细胞解毒的机制,在生长中没有任何明显的毒性症状。

表达谱芯片是用来分析植物基因表达模式的重要工具,使用跨物种杂交,即提取的RNA,与芯片探针来自于不同但是近缘的物种进行杂交,这种分析在过去的几年有过先例。

比如,为了研究重金属对植物的影响,Becher等人(2004)将A.alleri RNA样品与拟南芥Affymetrix微阵列杂交,并分析Zn处理对基因表达的影响。在同样的思路中, Hammond 等(2006)通过杂交N.cearulescens和Thlaspi arvense RNA到拟南芥 Affymetrix微阵列,来比较Zn作用下的基因调控; Van de Mortel 等 (2006)在文章中所述RNA来自用过量Zn处理或未处理的来自桉树RNA,与拟南芥表达谱芯片进行杂交。
短荚芥被报道与拟南芥在基因组上相似性非常高,在编码区域(Rigola等人,2006)中平均为88.5%的DNA相同,在基因间转录的间隔区中具有87%的DNA相同( Peer等人,2003)。因此做跨物种芯片杂交是可行的。


不耐受和不积累物种拟南芥对铅的响应被认为是对铅的标准植物响应,从对抗铅毒性来说,以往的数据表明短荚芥比拟南芥表现的更好(不展开讲)。假设植物的抗铅毒性是由可以介导金属离子结合的编码蛋白而引发的,那么通过本次实验,希望找到短荚芥的铅耐受的机制。

实验方法:Agilent  4*44K 拟南芥表达谱芯片 跨物种芯片杂交
为了确定植物的金属耐受机制,本次实验,采用了比较正常耐受植物(拟南芥),和铅超耐受植物(短荚芥)的根部和芽部位来寻找在超铅耐受植物中的特异性表达基因。

实验材料:



结果分析



1、表达谱差异比较 & Venn(维恩)比较

a表达谱差异比较:




结果说明:

差异表达基因的数量,短荚芥(H.incana)为2108(795+648+369+296)个,拟南芥(A.thaliana)为 14800(6737+7095+407+561)个,差异筛选标准为 假检测率(FDR)<0.1。
在短荚芥(H.incana)中,受到铅影响而表达变化的基因,有68.5%分布在根,有31.5%分布在芽.而在拟南芥(A.thaliana)中, 93.5%的铅响应基因分布在根中,6.5%分布在芽.
无论是短荚芥(H.incana)还是拟南芥(A.thaliana), 组织中上调和下调基因的比例大致相同,达到50%。
两个物种之间,铅响应基因的数量有明显差异,也许由于使用跨物种芯片杂交技术的缘故. 即使短荚芥(H.incana)和拟南芥是紧密相关的物种,不能排除一些短荚芥(H.incana)序列与拟南芥序列分歧太多,因此杂交不上去。)另一方面,在拟南芥芽中检测到的少量铅响应基因可能与处理的弱浓度有关。

PS:小编的观点是,这种情况下做转录组测序效果会更好。

b  Venn(维恩)比较:



铅根部(A)和芽(B)中的短荚芥(H.incana)还是拟南芥(A.thaliana)之间基因分布的维恩图。
+,上调;-,下调; ++,在两种物种中上调, --,在两种物种中下调,+-,在H.incana中上调,在拟南芥中下调,-+,在H.incana中下调,在拟南芥中上调。


结果说明:

为了寻找在铅-超累积和铅-耐受植物短荚芥(H.incana)中铅作用下的特异性调节的基因,比较了其转录组与普通耐受植物拟南芥的转录组。特别关注在H.incana根和芽中特异性铅调节的基因(铅特异性基因,H.incana补集)和在两种物种中调节的基因(铅共同基因,交集)。

铅特异性基因(H.incana补集)的数量在芽中比在根中更高,分别具有602(336+266)和341(196+145)个基因,表明芽的更强的反馈响应。相反,铅共有基因(交集)的数量在根中高得多, 1102(515+84+77+426)个基因,对比芽中的63(29+4+2+28)个基因 。上调和下调基因的分布在芽和根(55%上调基因)中相似。

2、铅响应候选基因的筛选



结果说明:

铅特异性基因中,仅保留了在基因表达中具有两倍变化(FC)的调节基因。 3它们在根中有121个基因(62+59),在芽中有330个(192+138)。

对于铅共有基因类别,进行两步筛选:

第一步,保留那些在H.incana中的差异表达基因 ((FDR)<0.1)中的, FC H. incana/FC A. thaliana > 2.0 或 < 0.5的基因,即在H.incana和拟南芥之间有显著差异的基因。这些基因在根中有315个,在芽中有28个。
在这个基础上第二步,选择铅处理前后具有两倍变化(FC)的调节基因。在第二步之后,铅-共有基因列表包括根中的227(125+102)个基因和芽中的26(18+8)个。


对于候选基因,是将铅特异性基因铅-共有基因基因,进行整合。所选基因列表包括根中的348(187+161)个基因,和芽的356(210+146)个基因。其中,在根和芽中都出现的基因为42个。

结合文献,如在引言中提到的,已知几种基因参与植物对铅暴露的耐受性反应,包括ACBP1 , AtATM3 , NtCBP4 , CNGC1 , HMA3 , HMA4 , AtMRP3,AtPDR8和AtPDR12 。与文献中的数据相反,本次的实验,对于ACBP1 , MRP3 , PRD8和PRD12,没有测到的杂交信号,并且对于ATM3,CBP4,CNGC1 , HMA3和HMA4虽然检测到杂交信号,但是没有差异表达。这个些说明了跨物种杂交芯片技术的限制。

后续的分析,从根中的348和芽中的356个基因出发进行功能富集分析和Genevestigator分析。

3、功能富集分析

为了评价差异表达基因在H.incana中对铅作用下的响应功能意义,在分析中使用Classification SuperViewer工具,基于MapMan对基因进行功能分类。


A 图为上调基因Mapman富集结果, B 图为下调基因Mapman富集结果。深色条形为芽的功能分析,浅色条形为根部功能分析。
Frequency=(上或下调基因在该功能中的个数 /该功能中的总基因数) /(上或下调总基因数/所有功能中的总基因数)
∗显著功能集合(p < 0.05); o, 差异基因少于5个


结果说明:

通过分析几种功能得到富集,分类为光合作用,细胞壁和金属结合

光合作用(Photosynthesis)

被认为是铅毒性最敏感的代谢过程之一( Singh等,1997 )。铅的毒性对光合CO2固定具有多功能的不利影响,降低光合色素的含量,改变叶绿体超结构,降低CO 2同化的酶活性( Parys等,1998 ; Islam等,2008 ; Belatik 等,2013 )。

芽部:在本研究中,分别直接参与光系统II编码的几个基因,光收获叶绿素a / b(Lhc)蛋白(At2g05070),Mog1 / PsbP / DUF1795样蛋白(At3g56650),NAD(P)H脱氢酶复合物亚基(At1g14150),PsbP样蛋白1(At3g55330)和光系统II反应中心亚基W(At2g30570)都在芽中下调。在卡尔文循环中涉及的三个基因(At3g12780,At1g56190和At1g73110)编码磷酸甘油酸激酶蛋白,在本次实验中发现也被下调。



根部:铅可以起到类似于镁的作用,其在高浓度下非竞争性地抑制磷酸甘油酸激酶活性( Larsson-Raźnikiewicz,1967 )。有趣的是,在根中观察到光合基因的增加的表达,特别是编码铁氧还蛋白1的At1g10960,其基因表达下调了2.5(1/0.414)倍。



因为根被认为是非光合器官,这种现象的生物相关性几乎没有受到注意,但本次实验,受影响的大多数基因(8/11)是Lhc家族的光合作用相关核基因的成员(At1g29910,At1g29930, At2g34420,At2g34430,At3g47470,At3g54890,At5g28450和At5g54270),并且可以在包括根尖在内的专门领域中表达( Sawchuk等人,2008 )。
Lhc基因表达,根和铅三者之间的相互作用有些不清楚,但是特别有趣的是脱落酸(ABA)是Lhc成员表达需要的,有缓解铅中毒的功能, 高水平的ABA将会增强的Lhc基因的表达( Liu等,2013 )。【注意,这里是伏笔】

细胞壁(cell wall)

最近在不同植物物种中的研究表明植物细胞壁在铅诱导下而被修饰( Krzeslowska,2011 )。细胞壁的修饰主要涉及多糖,特别是果胶的量的增加。

在本研究中,铅处理会诱导木葡聚糖内转葡糖基酶基因(At2g06850,At2g23730和At4g03210等)表达量的减少,继而引起细胞壁修饰和控制细胞伸长,从而在铅诱导根生长抑制中起重要作用。 类似的报道在拟南芥中也得到发现( Yang等人,2011 )。
芽部:



根部:


金属结合(metal handing)

根部:

从图可以看出,根中上调基因的横坐标 ,metal handing 的Frequency即频率大于10,即它是数据中富集程度最高的类别。



在与该类别相关的基因中,四个属于金属蛋白伴侣类蛋白家族(At4g39700,At5g17450,At1g22990和At4g08570)。些基因的表达受到了铅刺激而增加,倍数变化范围为2.6至13.9。这些金属蛋白的功能是未知的,但是其中两个(At1g22990和At4g08570)已知参与到了另一种重金属,表现为Cd耐受( Tehseen等人,2010 )。



金属处理类别中的另一个基因At2g28660编码蛋白,具有重金属结合结构域,如Cys-xx-Cys的的可溶性蛋白质,其中一段叶绿体靶向序列与铜伴侣家族相关( Abdel-Ghanya等人,2005 )。与对照相比,用铅处理的H.incana根中该基因的表达上调6.2倍。 

芽部:

在金属结合类别中,仅鉴定了在芽中上调的三个基因,并且其中的两个基因编码金属硫蛋白MT2a (At3g09390)和MT2b (At5g02380)。这两个基因的表达水平在用铅处理和对照的芽中分别为4.5和2.4。虽然金属硫蛋白在哺乳动物中,对Cd的保护作用是众所周知的( Klaassen等人,1999 ),但它们在植物中对重金属的耐受性的作用较不为人所知。已知MT2a定位于胞质溶胶并且可螯合重金属,但不参与液泡螯合( Lee 等,2004 )。



4、反向遗传方法进一步分析的候选基因

MT2a (At3g09390)和MT2b (At5g02380)研究基础:

在以前的研究中,使用拟南芥 T-DNA插入突变体证明MT2a在铅耐受中的作用( Auguy等,2013 ),发现MT2a基因参与铅耐受性。在本研究中鉴定的另一种金属硫蛋白基因是MT2b (At5g02380)。MT2b先前被描述为在所有器官的韧皮部中表达( Guo等人,2008 ),并涉及烟草中的Cd耐受性( Van Hoof等人,2001 ; Grispen等人,2011 )。 但是在对铅胁迫是否起作用,还没有报道。


(A) 拟南芥Mt2b基因(AT5G02380 )的内含子 - 外显子和T-DNA位置。实心黑框和实线分别表示编码区和内含子。2个T-DNA插入的位置由三角形指示。(B)和(C)分别在野生型生态型Columbia(Col0)和两个mt2b突变体系幼苗的根和枝条中的铅蓄积。在具有或不具有40μM铅溶液培养基上培养13天后收集幼苗。


结果说明:

为了研究MT2b基因作用,采用反向遗传法。构建了拟南芥的突变体,将其培养在含铅的培养基液中,测量MT2b突变体和野生型根和芽的铅含量。发现突变体根含量比野生型植物的根多1.5倍的铅,而且突变体的芽铅含量比野生型植株的芽低3.3倍。与野生型比较, 突变体主根生长没有受影响(结果未展示)。
这些结果表明,MT2b基因在铅胁迫下起作用,铅只能聚集到了根部,无法扩散到芽中。

5、与其它人结果的结合(Genevestigator)

利用Genevestigator基因表达数据挖掘工具中的Signature tool来完成。

利用这个工具,从整个GENEVESTIGATOR数据库中找到与自己的实验结果类似/完全相反的实验条件,通过这些试验条件,可以推测我们结果的实验解释机制。只需要输入基因的表达/差异表达值即可运行搜索,输入的结果可以来自定量PCR,表达谱芯片或者RNA-Seq。

在下述中,我们输入的从根中的348和芽中的356个基因,及其表达差异值(铅vs 正常),寻找哪些比较实验条件下与输入基因表达趋势相同。实验结果的相关性越高, 在排名约靠前。

结果说明:
根部看,和铅处理相关性最高的实验分别是:



芽部看,和铅处理相关性最高的实验分别是:



结合这两个表格看,与我们Pb实验最显着相似的实验包括来自非生物胁迫相关研究的数据,主要是盐胁迫相关(Salt),渗透相关(Osmotic)和干旱实验(Drought)以及脱落酸(ABA)研究。

通过ABA的生物合成通路发现,at5g67030,at1g08550,at3g14440等等,这些基因在铅处理后的根,芽中为上调表达。表明当H.incana植物于Pb处理时,诱导ABA生物合成。



有趣的是,参与ABA分解代谢途径的Atg52400基因也被大量下调,也导致潜在的ABA积累。脱落酸ABA作为胁迫信号,已知增强植物对若干环境胁迫(包括低温,盐,干旱和重金属)的耐受性( Bellaire等人,2000 ; Verslues和Zhu,2005 ; Hong等人,2013 ; Li等人,2014 )。

耐受性如何得到增加?

一方面是由于抗氧化防御系统的增强,其防止ROS的积累( Bellaire等,2000 ; Jiang和Zhang,2002 )。

另一方面,在与铅接触的植物中,蒸腾作用减弱( Barcelo和Poschenrieder,1990 )。细胞中铅的积累导致ABA在芽中的积累,导致气孔闭合,并通过蒸腾减少水的损失( Parys等人,1998 ; Pourrut等人,2011 )。总之,这些数据表明植物对铅和ABA途径的耐受性之间的复杂关系。

最近, Shukla等人在拟南芥实验中也得到了类似的结论(2014) ,这些线索建议ABA介导的信号可能是植物响应重金属胁迫的主要机制 。

结论

铅超累积和铅耐受植物短荚芥(H.incana)和铅-普通模型植物拟南芥之间的转录组比较,鉴定了响应于铅暴露差异表达的一组基因。
通过功能富集发现,光合作用,细胞壁结构和金属处理生物过程与铅耐受显著相关。
用反向遗传学证明MT2b这一金属硫蛋白基因,在芽中对铅积累和分布的重要作用。
此外,参与ABA生物合成途径的几个基因响应于铅处理而上调,表明ABA介导的信号传导涉及植物对铅的反应。
短荚芥(H.incana)可以被认为是一个良好的实验模型,以确定参与植物铅耐受和积累的基因。